DIGESTI

Laporan Praktikum Genetika
DIGESTI (PEMOTONGAN DNA) DENGAN ENZIM RESTRIKSI
Faiq Anan M*), A.R. Junaid, D.C. Waluyo, D. Oktavia, N. Nikita, R. Guspratiwi, P.S. Pangestu
Universitas Indonesia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Departemen Biologi
Mei 2011



Abstrak

Digesti merupakan suatu metode pemotongan fragmen DNA menggunakan enzim restriksi. Pemotongan bertujuan mendapatkan suatu sekuens yang spesifik. Enzim restriksi dapat memotong secara spesifik fragmen-fragmen pada DNA. Hasil pemotongan dapat berupa ‘sticky’ dan ‘blunt’. Penamaan enzim restriksi menggunakan sebuah sistem nomenklatur sendiri. Telah dilakukan praktikum digesti (pemotongan fragmen DNA) dengan enzim restriksi. Jenis enzim restriksi yang digunakan adalah BanI. Hasil praktikum divisualisasi dalam geldoc yang sebelumnya dielektroforesis terlebih dahulu. Terlihat band yang telah dipotong oleh enxim restriksi.

.
Kata kunci: Enzim restriksi, sticky end, digesti







1. Pendahuluan

DNA hasil isolasi masih berupa sekuens yang panjang dengan fragmen-fragmen yang masih saling berikatan. Pemotongan dengan suatu enzim pada DNA tersebut dilakukan untuk menghasilkan sekuens DNA tertentu yang spesifik. Enzim restriksi dapat mengenali situs penganalan pada DNA secara spesifik dan memotongnya secara spesifik.
Digesti merupakan proses pemotongan fragmen DNA dengan menggunakan suatu enzim khusus yaitu enzim restriksi. Enzim restriksi yang digunakan yaitu enzim restriksi endonuklease yang akan mengenali dan memotong fragmen DNA pada sekuen yang spesifik. Fragmen yang dipotong akan digabungkan dengan suatu fragmen DNA lain yang berperan sebagai vektor. Vektor merupakan molekul DNA yang dapat bereplikasi secara autonom yang akan memfasilitasi proses manipulasi dan identifikasi molekul DNA rekombinan yang terbentuk (Klug & Cummings 1994: 383).
Prinsip dasar dari teknologi DNA rekombinan adalah sebuah golongan enzim yang disebut restriksi endonuklease. Enzim ini diisolasi dari bakteri, diperoleh dari namanya karena mereka membatasi atau mencegah infeksi virus dengan memotong asam nukleat yang datang. Enzim restriksi mengenal sebuah sekuen nukleotida spesifik dan menghasilkan suatu kerusakan dobel helix di dalam atau di dekat dari sekuens (Klug & Cummings 1994 : 384).
Situs pemotongan enzim restriksi terdapat dua macam, yaitu di dalam lokus dan di tepi lokus, atau bisanya disebut eksonuklease dan endonuklease. Sedangkan hasil pemotongan terdapat dua yaitu, blunt end dan sticky end. Blunt end menghasilkan hasil akhir pemotongan yang tumpul, sedangkan pada sticky end menghasilkan pemotongan yang lancip. Pemotongan blunt end menghasilkan masalah ketika dicoba untuk diklonkan. Hal ini berbeda dengan hasil sticky end yang lebih efisien (Reece 2004: 187--188). Pemotongan enzim restriksi yang dapat menghasilkan ujung yang dinamakan “sticky” yang dapat saling menempel antara ujung DNA satu dengan ujung DNA yang lain. Kedua DNA dengan ujung sticky jika ditempatkan pada kondisi yang tepat, maka dapat membentuk molekul rekombinan dengan menempelkan kedua ujungnya. Penempelan kedua ujung dibantu oleh enzim ligase (Klug & Cummings 1994: 384).
Dua jenis enzim erestriksi endonuklease telah ditemukan, dan lebih dari 80 enzim dari ketiga tipe sudah dikenali. Enzim restriksi tipe I mengenali suatu DNA pada suatu lokasi secara acak pada beberapa jarak dari situs pengenalannya. Enzim restriksi tipe II mengenali suatu sekuens spesifik dan memotong dengan tepat kedua untai di dalam sekuens. Enzim restriksi tipe II ini, situs pengenalannya berupa palindromik yang membaca secara sama arah 5’ ke 3’ pada untai komplementer. Tipe III enzim restriksi mengenali urutan DNA yang spesifik dan memotong di dekat situs pengenalannya, biasanya sekitar 25 bp. Dari 3 jenis, enzim tipe II yang sering digunakan pada genetic engineering. Satu diantara enzim yang ditemukan berasal dari E. coli dan telah diberi nama ECoR1 (Klug & Cummings 1994 : 384 ; Pierce. 2002: 510).
Nomenklatur enzim restriksi berasal dari tiga huruf pertama dari singkatan untuk setiap enzim restriksi mengacu pada spesies bakteri dari mana enzim diisolasi (misalnya, Eco mengacu pada E. coli). Huruf keempat dapat merujuk pada strain bakteri dari mana enzim diisolasi (huruf "R" dalam EcoRI menunjukkan bahwa enzim ini diisolasi dari RY13 strain E. coli). Angka Romawi yang mengikuti huruf memungkinkan enzim berbeda dari spesies yang sama untuk diidentifikasi. Untuk kenyamanan, ahli genetika molekuler telah menyebutksn dengan istimewa pengucapan nama-nama tersebut, misal : EcoRI dilafalkan "echo-R-one," adalah HindIII "hin-D-three," dan HaeIII adalah "hae-three." lafal ini umum tidak mematuhi aturan-aturan formal dan hanya harus dipelajari (Pierce. 2002: 511).
Perkembangan teknik-teknik biologi molekular, salah satunya menciptakan teknik digesti yang dapat diaplikasikan dalam penelitian genetik serta mempermudah dalam mendapatkan DNA yang mengkode gen spesifik dalam jumlah besar. Selain itu, digesti merupakan salah satu teknik yang mendukung studi ekspresi, struktur, dan organisasi gen. Metode tersebut juga mendukung perkembangan industri bioteknologi yang telah menghasilkan banyak produk di tingkat pasaran (Klug & Clummings 1994: 384).
Praktikum digesti (pemotongan fragmen DNA) dengan enzim restriksi dilakukan dengan tiga tujuan. Pertama, mengetahui pengertian dan prinsip kerja digesti. Kedua, memahami dan mengetahui fungsi enzim restriksi. Ketiga, mengetahui aturan nomenklatur enzim restriksi..

2. Metodologi

Praktikum digesti (pemotongan fragmen DNA) dengan enzim restriksi menggunakan alat-alat dan bahan-bahan tertentu. Alat-alat yang digunakan pada praktikum Digesti (pemotongan DNA) dengan enzim restriksi yaitu, mikropipet, tube, sarung tangan, tabung 1,5 ml, kotak es dan inkubator. Bahan-bahan yang digunakan yaitu, enzim BanI 20 U/μl, Buffer NE4 10x, Nuclease free water, sampel DNA darah.
Cara kerja yang dilakukan yaitu pertama reaction mixture dimasukkan ke dalam tube. Reaction mixture berisi enzim BanI 0,5 μl, Buffer NE4 10x 1,2 μl, Nuclease free water 3,65 μl dan amplikon 10 μl. Kedua, tube diinkubasi selama empat jam pada suhu 37oC. Ketiga, hasil inkubasi dielektrolisis kemudian hasilnya divisualisasi pada geldoc.

3. Hasil Pengamatan

Hasil yang diperoleh pada praktikum digesti fragmen DNA dengan enzim restriksi yaitu visualisasi gel doc hasil digesti yang dapat dilihat pada gambar berikut.





















4. Pembahasan

Enzim restriksi yang digunakan dalam praktikum yaitu enzim BanI U/µl. Enzim tersebut berasal dari bakteri Bacillus aneurinolyticus (IAM 1077). Panjang sekuensnya 354 AA dan berfungsi dalam molekular sebagai endonuklease, hydrolase dan nuklease. Marka yang digunakan dalam praktikum yaitu Marker Øx/HaeIII. Jenis marka tersebut memiliki dua tipe yaitu N3026L dan N3026S. marka N3026L memiliki ukuran 250 gel lanes dengan konsentrasi 1000 mg/µl. Marka N3026S memiliki ukuran gel lanes dengan konsentrasi 1000 mg/µl.
Berdasarkan hasil visualisasi dapat ditentukan ukruan berat suatu protein dengan menggunakan marka. Semua sampel dari kelompok 1B sampai kelompok 5B memiliki dua band yang spesifik yaitu ukuran antara 118b--194bp dan 234 bp. Sedangkan sampel kelompok 6B hanya mempunyaiampel satu band yang berukuran antara 310bp--603bp.
Berdasarkan literatur, proses digesti diawali dengan pengenalan fragmen DNA sampel pada sekuen yang spesifik oleh enzim restriksi, dalam hal ini enzim restriksi endonuklease. Fragmen kemudian bergabung dengan molekul DNA lain yang berperan sebagai vektor. Vektor terserbut dapat melakukan replikasi secara autonom atau mandiri dan membantu proses pembentukan molekul DNA rekombinan. Vektor kemudian dimasukkan ke dalam host cell, tempat dihasilkan kopian fragmen DNA yang dinamakan Clones. Clones merupakan molekul DNA rekombinan yang mengandung vektor dan fragmen DNA sampel yang telah mengalami replikasi. Clones kemudian diisolasi dari host cell, dipurifikasi, dan dianalisis (Klug & Cummings 1994: 383).
Proses digesti menggunakan larutan nuclease free water, larutan ini digunakan sebagai pelarut dari semua bahan-bahan. Kemudian Buffer NE4 10x, larutan ini digunakan untuk menjaga pH larutan selama proses digesti. Selain itu juga digunakan enzim BanI yang akan mengenali dan memotong fragmen DNA sampel pada sekuen yang spesifik.


5. Kesimpulan

Kesimpulan yang didapat praktikan dari praktikum digesti (pemotongan fragmen DNA) dengan enzim restriksi yaitu :
1. Digesti merupakan proses pemotongan DNA menggunakan enzim restriksi.
2. Enzim restriksi merupakan suatu enzim yang dapat memotong secara spesifik sekuens tertentu pada suatu DNA.
3. Penamaan enzim restriksi berdasarkan nama bekteri yang digunakan, baik nama genus maupun nama spesies, nama strain bakteri dan nomor bakteri tersebut digunakan sebagai bahan pembuatan enzim.

6. Daftar Pustaka

Klug, W. S. & M. R. Cummings. 1994. Concept of genetics. 4th Ed. Prentice Hall, Englewood cliffs: xvi + 779 hlm.
Pierce, B.A., GENETICS: A Conceptual approach, 3th Ed. 2002. Paperback: xxv + 711 hlm.
Reece,.J.R.2004.Analysis of genes and genomes.J.H. Willey & Sons : xvii + 459 hlm.